Pentobarbital wird normalerweise als intravenöses Narkosemittel verwendet. Zu den neuen Formen gehört auch lösliches Pulver zur oralen Verabreichung. Es wird auch zur Kontrolle schwerer Anfälle bei Tieren zur Behandlung von Status epilepticus verwendet. In einigen Fällen ist Pentobarbital in Mischungen enthalten, die zur Euthanasie eingesetzt werden.
Pentobarbital als Natriumsalz wird als Beruhigungsmittel und Hypnotikum zur kurzfristigen Behandlung von Schlaflosigkeit verwendet.
Häufige Nebenwirkungen sind Schwindel, Gleichgewichtsstörungen, Koordinationsverlust, Schläfrigkeit, Verstopfung, Übelkeit, Erbrechen, Schlafstörungen, Albträume und überaktive Reflexe.
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